Fiche Résumé 05-AEP-12

Il est important de pouvoir rapidement connaître le risque de présence de la microcystine LR dans les eaux brutes destinées à la production d’eau potable. Cette microcystine est une toxine neurotoxique et cancérigène, libérée (non systématiquement) par les cyanobactéries (ou algues bleues), et pour laquelle une valeur limite existe désormais en ce qui concerne l'eau potable (1 µg/l). Cette toxine, qui fait partie des plus répendues et des plus toxiques, est en fait un indicateur de présence éventuelle d'autres toxines et sa recherche est recommandée lorsque les cyanobactéries ont été identifiées dans le milieu naturel.

Les techniques disponibles permettant la séparation et l’identification des toxines (colorimétrie, LC/UV et/ou LC/SM ; LC/SM ; HPLC/UV) sont lourdes en manipulation donc ne correspondent pas aux attentes des analyses d’autosurveillance en routine. L’objectif de l’étude est par conséquent de mettre au point une méthode d’analyse de routine simple et rapide permettant de vérifier la teneur en toxine algale contenue dans l’eau potable. Le protocole à définir sera basé sur la technique de chromatographie liquide haute performance (HPLC) couplée à un détecteur UV à barrette de diodes (LC/DAD).

Quatre toxines ont été étudiées : microcystines LR (L = leucine, R = arginine), LW (W = tryptophane), LF (F = phénylalanine) et RR. Les premiers essais ont été orientés pour vérifier que la technique LC/DAD permet bien de visualiser les toxines et pour optimiser les paramètres chromatographiques de façon à obtenir un chromatogramme exploitable pour chaque microcystine. Les paramètres qui ont pu être optimisés sont :
- phase mobile : ajout de 0,05 % de TFA (acide trifluoroacétique), le TFA est indispensable pour l’élution des microcystines : sans TFA les toxines sont piégée dans la colonne
- type de colonne : ZORBAX Bonus-RP,
- gradient de solvant : eau+0,05 % TFA/acétonitrile+0,05 % TFA.
Les temps de rétention des toxines ont également été étudiés (ordre d’élution : RR, LR, LW et LF). Cependant, leur connaissance ne suffit pas toujours à une identification systématique : il y a par exemple un pic parasite pour la toxine RR. Il est donc quasi-impératif d’utiliser la spectrométrie de masse pour lever ce genre d’ambiguïté.

Puis la méthode a été bonifiée en ajoutant une étape préalable de concentration de l’échantillon par SPE (extraction en phase solide) sur cartouches polymérique (PLRP-S). La SPE est nécessaire, dans le cas d’échantillon d’eau réelle où la concentration en toxine est faible, car elle permet d’avoir des pics chromatographiques de taille significative susceptibles d’améliorer la limite de détection. La limite de quantification obtenue lors des essais est de 0,3 µg/l ce qui est suffisant vis-à-vis de la norme de 1 µg/l établit par l’OMS. Par contre, le rendement d’extraction obtenu n’a pas été satisfaisant. Mais malgré ce mauvais rendement, la bonne linéarité des toxines dans l’intervalle 0,3 à 5 µg/l ainsi que la faible limite de quantification de 0,3 µg/l font que la méthode semble valable et applicable dans le cadre fixé.

Les essais doivent se poursuivre pour : confirmer la limite de quantification de 0,3 µg/l, déterminer la limite de détection, étudier la répétabilité des mesures. Ensuite, il faudra appliquer la méthode SPE/LC/UV à des échantillons d’eau réelle et valider le kit immuno-enzymatique ELISA comme étape préalable qualitative, révélatrice de la présence de microcystines. En effet, le kit ELISA ne renseigne que sur la teneur globale en microcystines. Ainsi, un protocole en deux étapes sera élaboré : appréciation qualitative de la présence ou non de cyanotoxines (utilisation du kit immuno-enzymatique ELISA) puis séparation et évaluation quantitative des cyanotoxines par SPE/LC/UV.

Note : Parallèlement à ces travaux, des essais ont été réalisés pour étudier la détection et la quantification des cyanobactéries hépatotoxiques par PCR (amplification du gène mcyA-J présent chez les cynobactéries productrices de microcystines). Les résultats ont montré que la quantification de Microcystis (amorce MAES-MAER) et de Planktothrix (amorce PSPS-PSPR) est possible par cette technique. Malheureusement, le rapport d’étude n’est pas disponible.