Fiche Résumé 06-AEP-05

La réglementation impose que les eaux destinées à la consommation humaine ne contiennent pas de microorganismes, de parasites ou toutes autres substances constituant un danger potentiel pour la santé des personnes. A cette fin, le contrôle de l’eau a été basé sur la recherche d’indicateurs de qualité reflétant le risque bactériologique. Pourtant, concernant le risque viral et le risque parasitaire, la limite de ces indicateurs de qualité traditionnels a été démontrée par plusieurs études épidémiologiques.

De nombreux travaux ont alors été menés ces dernières années pour améliorer les méthodes d’analyses de certains parasites comme Giardia et Cryptosporidium. Pour les virus, une norme AFNOR existe déjà concernant la recherche des entérovirus en culture cellulaire (XP T 90-451) mais elle pose des problèmes de spécificité et de sensibilité. Un gros travail de développement analytique reste donc à faire.

Par conséquent, l’objectif ultime de l’étude est de disposer d’une méthode analytique alternative pour estimer le risque viral lié à l’eau et pour évaluer l’efficacité des traitements de potabilisation. La méthode de base, majoritairement utilisée dans ce domaine et comportant une concentration, une purification et une détection, est alors reprise pour être optimisée. L’optimisation est axée sur les deux premières étapes de la méthode, soit la concentration et la purification, la détection ayant déjà fait l’objet d’études antérieures en 2001 qui ont abouti à la mise au point de la RT-PCR pour le Poliovirus (enterovius) et le virus de l’hépatite A. La RT-PCR est une méthode de détection par biologie moléculaire plus rapide, plus sensible et plus spécifique que la méthode normalisée par culture cellulaire. Le travail consiste donc à faire tendre les étapes de concentration et de purification vers les critères suivants : adaptabilité à tout type d’eau et sur une large gamme de virus quelle que soit leur concentration dans l’eau, rendement élevé de récupération de virus, répétabilité et reproductibilité élévées, compatibilité avec la détection, adaptabilité en routine. Une seule concentration-purification suffirait alors quelle que soit la méthode de détection utilisée et quel que soit le virus à analyser, la détection étant quant à elle spécifique à chaque virus recherché.

La phase bibliographique de l’étude (2004) a permis :
- de recenser et hiérarchiser les virus liés à l’eau selon leur degré d’importance ; 7 virus responsables d’hépatites et de gastro-entérites ont ainsi été identifiés : virus de l’hépatite A et E, rotavirus, norovirus, astrovirus, adénovirus et enterovirus ;
- de choisir une méthode de purification : celle qui utilise l’adsorption sur silice ;
- de dresser un inventaire des méthodes de concentration des virus à partir d’échantillon d’eau ; 4 méthodes intéressantes de concentration ont été répertoriées dont la méthode normalisée ; elles sont basées sur l’adsorption-élution ou l’ultrafiltration.

La phase expérimentale de l’étude (2005-2006) a permis d’évaluer la méthode de purification par adsorption sur silice et les 4 méthodes de concentration sélectionnées lors de la phase bibliographique, plus 3 autres méthodes de concentration développées en interne. Les essais ont été menés sur des eaux contaminées artificiellement par deux virus (le poliovirus et le virus de l’hépatite A, choisis en raison de la disponibilité de leur détection par RT-PCR) puis sur des eaux naturelles. La détection des virus a donc été réalisée par RT-PCR avec confirmation par culture cellulaire (méthode normalisée) pour les virus cultivables.

Les deux kits commerciaux d’extraction-purification testés, basés sur l’adsorption des acides nucléïques viraux sur de la silice, sont les kits NUCLISENS® et QIAGEN. QIAGEN a de beaucoup moins bons rendements que NUCLISENS® et nécessite une étape supplémentaire d’ultrafiltration amont pour éviter le colmatage. Le kit NUCLISENS® a donc été retenu même si sa mise en oeuvre est assez lourde en terme de manipulation. L’évolution de ce kit vers une version contenant de la silice magnétique offrirait une possibilité d’automatisation qui allègerait sa mise en oeuvre et permettrait une utilisation en routine.

Sur les 7 méthodes de concentration testées, deux sont plus efficaces que la méthode normalisée : la filtration sur membrane nylon et la double ultrafiltration. La filtration sur membrane nylon est plus facile à mettre en oeuvre et moins longue (35 mn contre 5 h pour l’ultrafiltration) mais présente quelques inconvénients que n’a pas l’ultrafiltration. L’un d’entre eux est d’avoir un volume analysable faible (de 0,3 à 1 l contre 20 à 30 l dans le cas de l’ultrafiltration) ce qui réduit les possibilités de trouver des virus. Un autre est l’obligation de refaire une filtration pour chaque virus recherché ce qui démultiplie d’autant le temps et le coût d’analyse. Par ailleurs, la filtration sur membrane nylon ne permet pas la détection par culture cellulaire (pour comparaison à la RT-PCR), ou alors en ajoutant une étape supplémentaire de décrochage des virus de la membrane qui alourdirait le protocole et serait une source de perte de rendement supplémentaire.

Ces deux méthodes ont ensuite été testées sur 44 échantillons d’eaux brutes karstiques (sans épisode de turbidité le temps de la campagne d’analyse) et 3 d’eaux distribuées représentant 12 sites différents. Sur certains échantillons, elles ont permis la détection de virus que la méthode normalisée n’a pas su repérer. Elles sont donc applicables à des eaux peu à moyennement turbides, la concentration par filtration sur membrane nylon étant plus adaptée en autosurveillance et la concentration par ultrafiltration plus adaptée à l’étude de points critiques en cas de pollution. Ces résultats très positifs encouragent à définir de nouveaux axes d’amélioration tels que l’automatisation du système de prélèvement sur site, l’automatisation de l’étape d’extraction... Il faudra également mettre au point la détection par RT-PCR pour les 5 autres virus sélectionnés à partir de la littérature.